近日，中國計量大學基于肝癌的血清樣本對比了美國Thermo Scientific公司的Top14高豐度蛋白去除試劑盒和青蓮百奧血液低豐度蛋白富集試劑盒（DMB）去除血清蛋白質組高豐度的效果[1]。結果表明DMB處理后的蛋白鑒定量在對照樣本和疾病樣本中分別是Top14的2.6和3.7倍，且DMB處理后低豐度蛋白質的鑒定覆蓋率更高。

圖1：3 種血清蛋白質組樣本制備方案的技術路線^[1]

研究思路和關鍵結果

1. 使用DMB、Top14兩種血清樣本前處理試劑盒以及Blank對照，完成3例健康人和3例肝癌患者的血清蛋白質組分析；

2. DMB處理組鑒定的蛋白質組和肽段數目最高且富集的低豐度蛋白數量更多；

3. DMB處理組鑒定的差異蛋白最多；

4. DMB處理組鑒定的蛋白質的GO和KEGG分析結果遠比Top14處理組和 Blank組豐富；

5. DMB處理組篩選出6個特征蛋白，可作為肝癌篩查候選生物標志物。

研究結果

一、肝癌血清樣本蛋白質和多肽的鑒定

該研究分別采用了DMB、Top14兩種血清樣本前處理試劑盒以及Blank對照，完成了3例健康人和3例肝癌患者的血清蛋白質組分析。在各樣本中，Top14處理組蛋白質和肽段鑒定數目均高于Blank組，DMB處理組鑒定的蛋白質組和肽段數目最高（圖2a）。在HC中，DMB處理組特征鑒定的蛋白質組數量是 Top14處理組的2.6倍，是Blank組的3.9倍；在HCC中，DMB處理組特征鑒定的蛋白質組數量是Top14處理組的3.7倍，是Blank組的6.2倍。此外，Top14處理組和Blank組鑒定蛋白質組的豐度信息相近，DMB處理組鑒定蛋白質組的豐度較低（圖2d）。綜合表明，DMB方案在富集血清樣本中的低豐度蛋白質效果最佳。

圖2：蛋白質和多肽的鑒定情況

二、3種血清樣本前處理方案的穩定性評價

該研究分別基于Proteome Discoverer搜庫和MaxQuant搜庫結果統計蛋白鑒定穩定性和定量穩定性。在HC中，DMB處理組鑒定頻率為2的蛋白質數目高于其他兩組，比Top14處理組多鑒定43個（57.3%），比Blank組多鑒定68個（136%）；DMB處理組鑒定頻率為3的蛋白質數目同樣高于其他兩組，比Top14處理組多鑒定69個（25.3%），比Blank組多鑒定143個（71.9%）（圖3a）。在HCC中，DMB處理組鑒定頻率高的蛋白質數目依然高于其他兩組，增加幅度比在HC中大（圖3b）。但是DMB處理組的穩定性相對較差，這與鑒定頻率為2的蛋白質數目較多有密切關系（圖3c,d）。

圖3：3種血清樣本前處理方案的穩定性評價

三、各方案特征鑒定蛋白質的GO和KEGG分析

使用clusterProfile分別對各組實驗在HC和HCC中特征鑒定的蛋白質進行GO和KEGG分析。DMB處理組特征鑒定的蛋白質的GO和KEGG富集結果均最豐富，相對于Top14處理組和Blank組有顯著變化（圖4a），在KEGG富集結果中表現得最為明顯。DMB處理組特征鑒定的蛋白質主要參與的信號通路有ECM-受體相互作用、白細胞跨內皮遷移和肌動蛋白細胞骨架的調節等。

圖4：各方案特征鑒定蛋白質的GO和KEGG分析

四、健康人群和肝癌人群血清樣本差異蛋白質組分析

該研究基于健康人群和肝癌人群的血清樣本，比較了DMB和Top14血液樣本前處理試劑盒相對于血清原液在蛋白質組差異分析中的優勢。Blank組共獲得17 個差異蛋白，Top14處理組共獲得15個差異蛋白，DMB處理組共獲得47個差異蛋白，在肝癌人群中表達上調的有41個，下調的有6個（圖5a-e）。差異基因的PCA分析可以很好地區分健康人群和肝癌人群。3組實驗的差異蛋白質組分析均可發現在肝癌血清樣本中顯著上調的基因，但在獲得的差異基因數量上和所行使的功能上有所不同，這對于理解肝癌的發生發展分子機制有影響。

圖5：Blank、Top14和DMB樣本制備方案肝癌血清樣本差異蛋白質組分析

五、基于DMB組差異基因的PPI分析

基于上述分析結果，相較于Blank組和Top14處理組，DMB處理組對血清中低豐度蛋白的鑒定效果有顯著提升，特征鑒定蛋白的功能富集結果更加豐富，發現的差異表達基因數量明顯增多。使用String對DMB組差異基因進行蛋白質互作網絡（protein-protein interaction networks,PPI）分析。該網絡圖包含37個節點，其中HSP90AB1、SPP1、ACTR3、SNCA、PECAM1和SRC在健康人群和肝癌人群中表現出顯著差異（圖6b），可作為肝癌篩查候選生物標志物。

圖6：基于DMB前處理方案在肝癌血清樣本的差異蛋白質組分析

研究結論

本研究討論了基于Top14和DMB血液樣本前處理試劑盒相對于血清原液在蛋白質組分析中的優勢，以及Top14和DMB2種試劑盒在蛋白質組分析中的優劣勢。在肽段和蛋白質鑒定方面，DMB處理組蛋白質的鑒定數量遠高于Top14 處理組和Blank組。DMB處理組對低豐度蛋白的鑒定有更好的結果。DMB特征鑒定的蛋白質的GO和KEGG分析結果遠比Top14處理組和Blank組豐富，證明了DMB處理組鑒定蛋白質的多樣性。

參考文獻

[1]趙佳威,陸澳,趙洋等.血清蛋白質組高豐度蛋白去除方法比較研究[J/OL].質譜學報:1-12[2024-03-20].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20240318.1717.003.html.